多菌灵单克隆抗体；多菌灵抗原

多菌灵 - BSA（OVA）偶联抗原的偶联位点通常是多菌灵半抗原上的活性基团与载体蛋白（BSA 或 OVA）上的氨基（-NH₂）、羧基（-COOH）等发生反应形成化学键。

例如，采用碳二亚胺法时，多菌灵半抗原上的羧基被碳二亚胺活化后与载体蛋白上的氨基发生缩合反应，形成酰胺键，实现偶联。

多菌灵 - BSA（OVA）偶联抗原的偶联比参数一般在 20 - 50∶1 之间。即每分子载体蛋白结合 20 - 50 个多菌灵半抗原分子。例如在某些实验中，通过紫外扫描法鉴定半抗原与载体蛋白的偶联，估算出多菌灵半抗原与 BSA、OVA 的结合比分别为 17∶1 和 15∶1，也属于较好的偶联效果。

多菌灵 - BSA（OVA）偶联抗原是将多菌灵半抗原与牛血清白蛋白（BSA）或卵清白蛋白（OVA）通过化学方法偶联形成的一种人工抗原，在免疫检测等领域有重要应用。

制备目的

多菌灵是一种广泛使用的苯并咪唑类杀菌剂，直接用多菌灵作为抗原免疫动物难以产生高效价的抗体。将多菌灵与具有良好免疫原性的载体蛋白 BSA 或 OVA 偶联，可增加多菌灵的分子量和免疫原性，使动物免疫系统能够识别并产生针对多菌灵的特异性抗体，为后续多菌灵的免疫检测方法如酶联免疫吸附测定（ELISA）、免疫层析等提供关键的抗原物质。

制备方法

多菌灵半抗原的合成：一般通过对多菌灵分子进行化学修饰，引入可与载体蛋白偶联的活性基团，如在多菌灵的苯环上引入羧基、氨基等基团。例如，以多菌灵为原料，通过硝化、还原、重氮化及水解等反应，可在多菌灵分子上引入羧基，得到多菌灵半抗原。

偶联反应：常用的偶联方法有碳二亚胺法、混合酸酐法、活泼酯法等。以碳二亚胺法为例，先将多菌灵半抗原与碳二亚胺（如 EDC）反应，使半抗原的羧基活化，然后与载体蛋白（BSA 或 OVA）上的氨基发生缩合反应，形成稳定的酰胺键，从而实现多菌灵半抗原与载体蛋白的偶联。

鉴定方法

紫外光谱法：多菌灵、BSA（OVA）及偶联抗原在紫外区有不同的吸收峰。通过对比多菌灵、载体蛋白及偶联抗原的紫外吸收光谱，若偶联抗原在多菌灵和载体蛋白的特征吸收波长处均有吸收，且吸收峰强度发生变化，可初步判断偶联成功。

SDS - PAGE 电泳：将偶联抗原与未偶联的载体蛋白进行 SDS - PAGE 电泳，由于偶联抗原分子量增大，其在凝胶中的迁移速度会变慢，与载体蛋白形成不同的条带，从而直观地证明偶联反应的发生。

多菌灵单克隆抗体是一种针对多菌灵这一特定抗原产生的高度特异性和均一性的抗体，在农药残留检测等领域发挥着重要作用。

制备过程

免疫原制备：通常将多菌灵与载体蛋白（如牛血清白蛋白 BSA 或卵清白蛋白 OVA）偶联，形成多菌灵 - BSA（OVA）偶联抗原，以增强多菌灵的免疫原性。

动物免疫：选择合适的实验动物，如 Balb/c 小鼠，将多菌灵 - BSA（OVA）偶联抗原与弗氏佐剂混合后，通过皮下、腹腔等途径注射到小鼠体内，进行多次免疫，使小鼠免疫系统产生针对多菌灵的 B 淋巴细胞。

细胞融合：取免疫后的小鼠脾脏细胞（含有产生抗体的 B 淋巴细胞）与骨髓瘤细胞，在聚乙二醇（PEG）等融合剂作用下进行细胞融合，形成杂交瘤细胞，兼具 B 淋巴细胞产生特异性抗体能力和骨髓瘤细胞无限增殖特性。

筛选阳性杂交瘤细胞：利用酶联免疫吸附测定（ELISA）等方法，将多菌灵抗原包被在酶标板上，加入细胞培养上清液，筛选出能产生抗多菌灵单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞。

克隆化培养：采用有限稀释法或软琼脂平板法等对阳性杂交瘤细胞进行克隆化培养，获得单个细胞的克隆，确保产生的抗体具有高度均一性，经多次筛选获得稳定分泌高亲和力多菌灵单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

单克隆抗体的大量制备：通过体内培养（将杂交瘤细胞接种到小鼠腹腔内，从腹水中获取抗体）或体外培养（利用细胞培养技术在生物反应器中培养杂交瘤细胞，收集培养液获得抗体）大量制备多菌灵单克隆抗体。

特性

高度特异性：只针对多菌灵的特定抗原表位起作用，与其他农药或化合物的交叉反应率极低，能准确识别和检测多菌灵，可减少检测中的假阳性结果，提高检测准确性和可靠性。

高度均一性：由单一杂交瘤细胞克隆产生，抗体的分子结构、氨基酸序列和生物学特性等高度一致，在检测中性能稳定，批间差异小，可重复性好，有利于标准化检测方法的建立和质量控制。

应用

残留检测：是多菌灵残留免疫分析的核心试剂，基于其建立的 ELISA、胶体金免疫层析试纸条、免疫传感器等方法，可快速、灵敏地检测农产品、环境水样、土壤等样品中的多菌灵残留量，为农产品质量安全监管和环境保护提供技术支持。例如，ELISA 试剂盒可在实验室对大量样品进行定量检测，胶体金试纸条可用于现场快速定性筛查。

免疫亲和层析：将多菌灵单克隆抗体固定在层析介质上制备成免疫亲和柱，当含有多菌灵的样品通过亲和柱时，多菌灵会与抗体特异性结合，其他杂质被洗脱，从而实现对样品中多菌灵的分离和富集，提高后续分析检测的灵敏度和准确性，常用于复杂样品的前处理。