17α羟孕酮(17-OHP) -BSA偶联抗原；17α羟孕酮(17-OHP) -OVA偶联抗原；17α羟孕酮偶联抗原；17OH-PROG

17α-羟孕酮(17-α-hydoxy progesterone，17α-OHP)

17α- 羟孕酮（17-OHP）-BSA/OVA 偶联抗原概述

一、偶联原理与方法

1. 载体蛋白选择

• BSA（牛血清白蛋白）：

• 分子量约 66 kDa，结构复杂，赖氨酸（Lys）残基丰富，适合作为免疫原偶联半抗原，诱导强免疫应答。

• OVA（卵清蛋白）：

• 分子量约 45 kDa，免疫原性较弱，但常用于包被抗原（如 ELISA 竞争法），减少与免疫血清的交叉反应。

2. 偶联方法（以碳二亚胺法为例）

1. 活化半抗原：

• 17-OHP 分子中的 ** 羟基（-OH）或酮基（C=O）** 需通过化学修饰引入羧基（-COOH），例如通过琥珀酸酐酯化生成 17-OHP - 琥珀酸单酯，暴露羧基。

2. 偶联反应：

• 在碳二亚胺（EDC）和 N - 羟基琥珀酰亚胺（NHS）催化下，半抗原羧基与载体蛋白（BSA/OVA）的赖氨酸氨基（-NH₂）形成酰胺键，完成偶联。

3. 表征验证：

• 紫外分光光度法：对比偶联前后载体蛋白的紫外吸收峰偏移（如 BSA 在 280 nm 处吸收峰变化）。

• SDS-PAGE 电泳：偶联物分子量大于载体蛋白，条带迁移率降低。

• 质谱法：精确测定偶联物分子量，计算半抗原与蛋白的偶联比（通常为 5-20 个半抗原 / 蛋白分子）。

二、应用场景

1. 免疫原制备（17-OHP-BSA）

• 目的：免疫动物（如兔子、小鼠）产生抗 17-OHP 的多克隆抗体或单克隆抗体。

• 注意事项：

• 免疫程序：通常需多次注射（初免 + 加强免疫），佐剂（如弗氏完全佐剂）增强免疫应答。

• 抗体筛选：通过间接 ELISA 检测血清效价，筛选高亲和力抗体。

2. 检测抗原制备（17-OHP-OVA）

• 目的：用于竞争法 ELISA或化学发光检测，原理如下：

• 包被抗原（17-OHP-OVA）与样本中的游离 17-OHP 竞争结合有限抗体，通过吸光度或发光值反推样本中 17-OHP 浓度。

• 优势：OVA 免疫原性低，可减少包被抗原与抗体的非特异性结合，提高检测灵敏度。

三、关键影响因素

1. 偶联比优化

• 偶联比过低：半抗原密度不足，免疫原性弱或检测信号低。

• 偶联比过高：载体蛋白空间位阻大，抗体结合表位被遮蔽，或导致非特异性反应增加。

• 优化方法：通过梯度偶联（如半抗原：蛋白 = 5:1、10:1、20:1），筛选最佳偶联比。

2. 半抗原连接位点

• 17-OHP 的17 位羟基是其特征结构，但偶联时需避免破坏该位点（否则可能影响抗体识别）。

• 解决方案：选择非关键位点（如 3 位酮基通过衍生化引入羧基）进行偶联，保留 17 位结构完整性。

3. 保存与稳定性

• 保存条件：冻干或 - 20℃分装保存，避免反复冻融。

• 溶解介质：溶于 PBS（pH 7.4）或生理盐水，避免使用含叠氮化钠（NaN₃）的溶液（可能干扰酶活性）。

四、质量控制指标

五、常见问题与解决方案

1. 抗体效价低

• 可能原因：偶联比不足、半抗原表位被遮蔽、免疫程序不合理。

• 解决方法：提高偶联比、更换偶联位点（如从 3 位改为 11 位衍生化）、增加免疫次数或更换佐剂。

2. 检测假阳性 / 假阴性

• 可能原因：包被抗原（17-OHP-OVA）与抗体交叉反应弱、样本基质干扰。

• 解决方法：优化包被浓度（如 5-10 μg/mL）、添加样本稀释液（含 BSA 或 Tween-20 减少非特异性结合）。

六、应用拓展

1. 临床检测：新生儿筛查 CAH 时检测血清 17-OHP 水平（正常参考值：新生儿 < 2 ng/mL，成人女性黄体期 < 3 ng/mL）。

2. 药物研发：监测甾体类药物（如孕激素）代谢过程中 17-OHP 的含量变化。

3. 科研工具：用于制备 17-OHP 标准品、抗体亲和力成熟筛选等。