猪新发冠状病毒N蛋白（原核表达）

猪新发冠状病毒通常指猪 δ 冠状病毒（Porcine Deltacoronavirus，PDCoV），以下是关于猪 δ 冠状病毒 N 蛋白原核表达的相关内容：

原核表达系统的选择

原核表达系统常选用大肠杆菌，如 BL21 菌株等。其具有遗传背景清楚、生长繁殖快、成本低、易于培养和大规模发酵等优点，能够高效表达外源蛋白。

表达载体的构建

基因获取：根据 GenBank 收录的 PDCoV HKU15-44 株等的 N 基因序列，设计一对扩增 N 全基因的引物，以重组质粒 PMD18-T-PDCoV-N 为模板，用 PCR 方法扩增出 N 全基因片段。

载体选择与连接：将扩增得到的 N 基因片段克隆至原核表达载体，如 pET-28a、pColdI 等中，构建重组表达质粒。pET-28a 载体带有 His 标签，便于后续蛋白的纯化；pColdI 载体则有利于低温诱导表达可溶性蛋白。通过双酶切和测序鉴定重组质粒的正确性。

诱导表达

诱导剂：一般采用 IPTG（异丙基硫代半乳糖苷）作为诱导剂，它可以与阻遏蛋白结合，解除对基因表达的抑制，从而启动目的蛋白的表达。

诱导条件优化：调整 IPTG 的浓度（0.1-1.0mM）、诱导温度（16-37℃）和诱导时间（2-24 小时）等条件，以获得最佳的蛋白表达量和可溶性。例如，在 IPTG 浓度为 0.5mM、诱导温度为 25℃、诱导时间为 12 小时的条件下，PDCoV N 蛋白的表达量较高且主要以可溶性形式存在。

蛋白纯化

镍柱纯化：如果使用的是带有 His 标签的表达载体，如 pET-28a，可以利用镍柱亲和层析法进行纯化。His 标签能够与镍柱上的镍离子特异性结合，从而将目的蛋白与其他杂蛋白分离，经过洗涤、洗脱等步骤，得到纯化的 N 蛋白。

其他方法：还可以采用凝胶过滤层析、离子交换层析等方法进一步纯化蛋白，提高蛋白的纯度。

蛋白鉴定

SDS-PAGE 分析：通过 SDS-PAGE 电泳，将蛋白按照分子量大小进行分离，观察蛋白条带的位置和纯度。纯化后的 PDCoV N 蛋白在 SDS-PAGE 胶上显示为单一的条带，分子量约为 44kD 或 28kD，与预期相符。

Western blot：利用特异性的抗体检测目的蛋白，验证其反应原性。将纯化的 N 蛋白转移到膜上，与相应的抗体进行孵育，再用二抗进行显色，若出现特异性条带，则表明表达的蛋白具有良好的反应原性